Аффинная хроматография. Общая характеристика метода
Страница 1

Биология » Возможности ионообменной хроматографии » Аффинная хроматография. Общая характеристика метода

Это - самый сложный, тонкий и, пожалуй, самый капризный метод хроматографии. Но зато, в случае успеха, - фантастически эффективный! С его помощью в одной хроматографической операции удается полностью очистить вещество, представленное в смеси с другими компонентами ничтожной долей - порядка нескольких сотых процента.

Аффинный означает родственный (от латинского af finis) или, точнее, обладающий сродством. Аффинная связь в нашем случае подразумевает биоспецифическое взаимодействие, отличающееся исключительной избирательностью. Такая избирательность лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме.

В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и антителами к ним, между многими малыми молекулами, например, витаминами и специфическими транспортными белками, доставляющими их в клетку.

Наконец, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, управляющими реализацией их функций: редупликацией, транскрипцией и трансляцией.

Любой из компонентов названных и им подобных биоспецифических пар можно надежно закрепить на хроматографической матрице в качестве так называемого "лиганда". С его помощью второй партнер такой пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами и временно задержан на матрице в составе биоспецифического (аффинного) комплекса.

После удаления всех посторонних примесей промывкой тем же элюентом, в котором осуществлялось образование этого комплекса, можно произвести замену элюента на такой, который нарушит биоспецифическую связь лиганда с его аффинным партнером. Это обеспечит быстрый выход последнего из колонки, на которой останется освобожденный для новых аффинных связей лиганд.

Биоспецифическое взаимодействие реализуется за счет тех же, хорошо знакомых нам сил связи, которые фигурировали в рассмотренных ранее видах хроматографии: электростатического притяжения разноименных ионов, водородных связей и сил гидрофобного взаимодействия.

Биоспецифичность определяется конформационным соответствием участков связывания на лиганде и веществе, в результате которого различные их взаимодействия осуществляются одновременно в нескольких точках и их эффекты суммируются.

Одна из тонкостей постановки опытов с использованием аффинной хроматографии заключается в создании условий, когда ни одна из этих нескольких связей не будет излишне прочной. В противном случае вещество не удастся "снять" с лиганда.

Вся суть метода заключается в конформационном соответствии. Ни одна из связей не является специфичной. Поэтому их разрыв при элюции очищенного вещества может быть осуществлен с помощью обычных приемов: изменением рН, увеличением ионной силы (иногда и температуры) элюента, введением в его состав органических растворителей и детергентов.

В некоторых случаях может потребоваться вмешательство денатурирующих агентов (мочевина, формамид), нарушающих само конформационное соответствие пары лиганд - вещество.

Из сказанного ясно, что главное преимущество аффинной хроматографии состоит в ее очень высокой избирательности. Вместе с тем, сам способ связывания вещества с матрицей через лиганд в условиях конформационного соответствия является, как правило, идеально мягким и, в отличие от других видов хроматографии, не угрожает нативности очищаемого вещества, например, его ферментативной активности.

Действительно, здесь фермент "садится" в точно соответствующую его конфигурации "ямку", между тем, как в ионообменной или распределительной хроматографии связывание с сорбентом хотя бы только в двух, но случайно расположенных, точках может существенно деформировать молекулу фермента.

В тех "некоторых случаях", когда элюцию фермента не удается осуществить без его денатурации, можно пойти по пути ослабления первичного биоспецифического связывания. Например, заменить в качестве лиганда истинный субстрат фермента на его аналог.

Немаловажным преимуществом аффинной хроматографии является и то обстоятельство, что в ней гидролитические ферменты (протеазы и нуклеазы) с самого начала отделяются от своих субстратов.

В частности, этим обстоятельством обусловлен высокий выход при очистке макромолекулярных препаратов. Кроме того, ввиду избирательной сорбции малой доли вещества, находящегося в исходной смеси, аффинную хроматографию отличает возможность использования больших объемов исходных препаратов. В ходе ступенчатой элюции осуществляется весьма эффективное концентрирование нужного вещества.

Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания лиганда с матрицей не должен создавать стерических препятствий для осуществления его аффинного взаимодействия с сорбируемым веществом.

Страницы: 1 2


Также смотрите:

Пульсирующий ритм развития сложных систем
Путь к единению, к интеграции различных частей в целое не является равномерным, постоянным и однонаправленным. Эволюционное восхождение ко все более сложным формам и организациям проходит через ряд циклов распада и интеграции, отпадения от целого и включения в него, т ...

Отношения между организмами
В структуре биоценоза находят отражение и отношения между организмами, которые невероятно сложны. В первую очередь это внутривидовые и межвидовые биотические отношения всех типов и трофические. В биоценозе организмы связаны также топическими, форическими и фабрическим ...

1952г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз.
Как известно, фаг Т2 является вирусом, инфицирующим бактерию E. coli. фаговые частицы абсорбируются на наружной поверхности клетки, их материал проникает внутрь и примерно через 20 минут бактерия лизируется, освобождая большое количество фаговых частиц - потомков. В 1 ...