Хроматографическое фракционирование белков
Страница 1

Биология » Ионообменная хроматография » Хроматографическое фракционирование белков

Мы подготовили материал для мысленного рассмотрения процессов закрепления молекулы белка на матрице ионообменника и его освобождения от связи с ней. Для первоначальной фиксации этой молекулы необходимо одновременное осуществление двух или, пожалуй, даже трех условий. Во-первых, белок должен подойти к нити полимера так, чтобы разноименно заряженные ионы на его поверхности и на нити сорбента оказались сближенными до расстояния, на котором эффективно действует кулоновская сила притяжения. Во-вторых (и в-третьих) оба сблизившихся иона должны быть не заблокированы контрионами. Хотя вероятность такого совпадения кажется и небольшой, но число столкновений с нитями ионообменника, которое испытывает каждая молекула белка за единицу времени настолько велико, что практически за несколько минут для каждой из молекул, находящихся внутри гранулы, благоприятная ситуация реализуется хотя бы однажды. Молекула в этот момент окажется связанной с матрицей. Ее поступательное движение прекратится, хотя под тепловыми ударами молекул воды молекула белка будет поворачиваться около единственной точки своей фиксации.

Оторвать макромолекулу белка от матрицы будет нелегко, потому что большая масса обусловит инерционность ее поведения, а также потому, что разнонаправленные импульсы ударов о поверхность белка многих молекул воды будут уравновешивать друг друга. Тем не менее, неизбежно наступит момент, когда равнодействующая этих импульсов окажется достаточно большой для того, чтобы удалить молекулу белка на такое расстояние, где кулоновское притяжение заметно ослабеет — молекула оторвется от матрицы. Если концентрация соответствующих контрионов в окрестностях обоих ионов будет мала и оба они в течение некоторого времени будут «открыты», то есть шанс, что отошедшая недалеко молекула белка за счет броуновского движения вновь сблизится с тем же самым ионом матрицы так, что восстановится ее первоначальная фиксация. Если же концентрация контрионов достаточно велика и хотя бы один из ранее взаимодействовавших ионов окажется заблокированным, белок окончательно оторвется от данной точки матрицы и возобновит свое диффузионное движение до тех пор, пока совпадение благоприятных условий не фиксирует его в новой точке внутри гранулы или пока он не покинет ее пределы и выйдет в окружающий элюент. Впрочем, в тот же момент из элюента в гранулу в процессе диффузии, вероятно, войдет точно такая же молекула белка.

Легко себе представить, что в первые же минуты после внесения смеси белков на колонку для каждого из них независимо установится динамическое равновесие распределения фиксированных и свободных молекул, отвечающее данным значением рН элюента и концентрации соли. А вместе с ним и динамическое равновесие концентраций этих молекул в подвижной и неподвижной фазах. (В отличие от гель-фильтрации, благодаря сорбции на обменнике равновесие концентраций будет сильно сдвинуто в сторону неподвижной фазы.)

После начала элюции свободно текущий элюент будет уносить молекулы, вышедшие из гранул, вниз по колонке. В результате чего динамическое равновесие концентраций в вышележащем слое будет восстанавливаться (на более низком общем уровне) за счет выхода молекул из неподвижной фазы в подвижную. А в нижележащем первоначально «пустом» слое гранул динамическое равновесие концентраций в двух фазах будет создаваться за счет перехода молекул из элюента в гранулы и их сорбции там. С новыми порциями свободного элюента, поступающего на колонку, этот процесс будет продолжаться, перенося все большее число молекул из вышележащего слоя в нижележащий . Таким образом зона связанного белка будет постепенно (и очень медленно) продвигаться вниз по колонке. Это продвижение будет происходить с различной скоростью у различных белков в соответствии с их индивидуальными особенностями. В первую очередь с количеством и пространственным расположением ионогенных групп на поверхности белка. Так будет продолжаться вплоть до выхода двигавшихся зон из колонки в виде более или менее узких «пиков» колоколообразной формы. Выходить эти пики будут, очевидно, в том же порядке и с такими же интервалами (или перекрытиями!), с какими двигались по колонке зоны связывания соответствующих белков. Это и есть истинный процесс хроматографического фракционирования.

До сих пор мы игнорировали возможность нахождения на поверхности белка двух и более ионогенных групп подходящего знака. Однако из приведенных ранее цифр следует, что расстояния между двумя такими группами на поверхности белковой глобулы и между ионогенными группами на ионообменнике имеют один и тот же порядок величины. Это означает возможность реализации следующей цепи событий.

Страницы: 1 2


Также смотрите:

Образование Земли
Земля образовалась 4.6 млрд. лет назад в протопланетном облаке. Но свое стационарное устройство земной шар обрел только 3.7 млрд. лет назад – именно этот возраст имеют самые древние горные породы, от возникновения которых начинается геологическая история Земли. В ней ...

Факторы защиты организма.
Важную роль в защите от проникших в организм человека чужеродных веществ играют лейкоциты или белые кровяные тельца. Они обеспечивают иммунитет – распознавание и нейтрализацию (разрушение, обеззараживание, удаление) генетически чужеродных веществ инфекционной и неинфе ...

Собственные исследования. Материал и методы
Наши исследования проводились с июля 2006 по февраль 2008 года. Основной их объем приходился на время прохождения преддипломной практики. Основные исследования проводились на территории Ромненского района. При проведении исследований мы проанализировали данные по чи ...