ВведениеСтраница 1
Актуальность проблемы. Микроорганизмы, существующие в условиях высокой солености, для поддержания осмотического равновесия между клеткой и внешней средой накапливают в клетках неорганические ионы или низкомолекулярные органические соединения – осмолиты или осмопротекторы. Стратегию осмоадаптации, связанную с аккумуляцией органических осмопротекторов – веществ, совместимых с основными метаболическими процессами в клетках, реализуют многие умеренно галофильные прокариоты. Среди них недавно обнаружены аэробные метилотрофные бактерии, выделенные из (гипер)соленых и щелочных водоемов (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии). Установлено, что аэробные галофильные метилотрофы накапливают циклическую иминокислоту эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат), глутамат и сахарозу (Khmelenina et al., 1999).
Биосинтез эктоина, широко распространенного в микробном мире осмопротектора, у гетеротрофных галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин (Galinski, 1995). В последние годы предпринимаются попытки детального изучения свойств ферментов и генов этого биохимического пути, что обусловлено практическими задачами получения эктоина, перспективного биопротектора, используемого в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток.
Специфические ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина – ДАБ-ацетилтрансфераза (EctА), ДАБ-аминотрансфераза (EctB) и эктоинсинтаза (EctС), частично охарактеризованы у Halomonas elongata (Ono et al., 1999), а так же у метанотрофной бактерии Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (Reshetnikiov et. al., 2006). Гены, кодирующие эти ферменты, идентифицированы у ряда гетеротрофных, автотрофных галофильных прокариот и метилотрофных бактерий, установлено расположение данных генов в одном опероне ectABC. Однако соответствующие сведения о свойствах ферментов и организации генов биосинтеза эктоина у галотолерантной метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina отсутствуют. В связи с вышеизложенным представлялось актуальным провести исследование ферментов и генов биосинтеза эктоина у M. marina для выявления степени сходства и/или возможных отличий от других бактерий.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:
1. Идентифицировать гены биосинтеза эктоина у M. marina, провести их филогенетический анализ.
2. Клонировать ген ectA, получить и охарактеризовать рекомбинантную ДАБ-ацетилтрансферазу.
3. Сконструировать плазмидную конструкцию, несущую ectABC гены под промотором метанолдегидрогеназы Pmax, для интеграции в хромосому негалофильной метилобактерии Methylobacterium еxtorquens AM1.
4. Измерить накопление эктоина в рекомбинантных клетках и в среде культивирования M. еxtorquens AM1.
Магистерская диссертация выполнена на базе ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, в лаборатории радиоактивных изотопов под руководством д.б.н., проф. Троценко Ю.А.
Научная новизна. Установлено, что в ответ на увеличение солености среды изучаемый галотолерантная метилотрофная бактерия накапливает в клетках эктоин. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina, относящейся к классу α-Proteobacteria. Показано, что у M. marina гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу (ectA), ДАБ-аминотрансферазу (ectB), эктоинсинтазу (ectC) и аспартаткиназу (ask), сцеплены и составляют оперон ectABC-ask.
Также смотрите:
Причины, обусловливающие динамику популяций
Вопрос о причинах, определяющих популяционную динамику, это вместе с тем вопрос о том, какие внутренние и внешние влияния испытывает популяция. Для получения ответа на него наряду со статистической обработкой материалов наблюдений в природе проводится экспериментально ...
Структура Земли
Форма Земли – геоид, он близок к эллипсоиду вращения. Планета слегка сплюснута у полюсов и вытянута у экватора. Разность экваториального и полюсного диаметров составляет около 43 км при значении среднего радиуса в 6371 км. Средняя плотность Земли примерно в 5,5 раза б ...
Выражение эмоций. Мимика
Многие считают, что дельфинам не присуща мимика, однако, это не так. Каждый, кто подолгу наблюдал за дельфинами, не только безошибочно узнает их по «физиономиям», но часто «по выражению их лиц» способен определить «настроение» каждого зверя. Хотя их морды действительн ...