Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1
Для интеграции генов биосинтеза эктоина из M. marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 был выбран вектор, мини-транспозон pBSL-180. Кассета для интеграции, входящая в состав pBSL-180, содержала конститутивный промотор метанолдегидрогеназы Pmax и ectABC гены. Данный вектор был сконструирован следующим образом. ПЦР-фрагмент, содержащий промоторную область Pmax, амплифицировали с плазмиды pCM-160, используя праймеры PmaxF-PmaxR, и клонировали по сайтам EcoRI и BamHI в pBSL-180 с образованием вектора pBSL/Pmax. ДНК-фрагмент, кодирующий гены биосинтеза эктоина ectABC, был амплифицирован из M. marina с использованием праймеров Ect-operC(hal) и Ect-operN(hal). ПЦР-фрагмент клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и HindIII в плазмиду pBSL/Pmax c образованием pBSL/Pmax/ectABC размером около 9 т.п.н. ( Рис 14)
|
Рис. 14. Схема клонирования генов биосинтеза эктоина(ectABC) из M. marina под промотором метанолдегидрогеназы(Pmax) в мини-транспозон pBSL-180.
Конструкцию pBSL/Pmax/ectABC трансформировали в клетки E. coli S-17(גpir). Полученные трансформанты E. coli использовали для конъюгации в дикий штамм M. extorquens AM1. Трансформанты M. extorquens, содержащие плазмиду pBSL180/Pmax/ectABC, выращивали на агаризованой минеральной среде К с метанолом и канамицином.
Наличие интегрированной кассеты Pmax/ectABC в хромосоме M. extorquens AM1 оценивали ПЦР с праймерами PmaxF и ectArev на Pmax и ectA (Рис 15).
M
~700 п.н.
Рис.15 Электрофорез ПЦР продуктов генов Pmax и ectA с использованием праймеров:
PmaxF и ectARev, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.
Трансформанты M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) выращивали на среде К с канамицином, клетки собирали центрифугированием. Экстракцию эктоина из клеток метанолом проводили в течение 2 ч. В полученных метанольных экстрактах количество эктоина анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе высокого давления Prominence, оснащенным детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония).
В полученных трансформантах M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) был обнаружен эктоин в концентрации 75 мкг на 100 мг сухих клеток (Рис. 16с), что свидетельствует об экспрессии генов ectABC с промотора Pmax.
А)
Б)
С)
Рис. 16 Анализ накопления эктоина используя метод ВЭЖХ: а) контроль эктоина (“Sigma”), б) дикий штамм M. extorquens AM1, с) рекомбинантный штамм M. extorquens AM1.
Также смотрите:
Класс паукообразные
Места обитания, строение и образ жизни.
К паукообразным относятся пауки, клещи, скорпионы и другие членистоногие, всего более 35 тыс. видов. Паукообразные приспособились к жизни в наземных условиях обитания. Лишь некоторые из них, например паук-серебрянка, вторично п ...
Расчет площадей для разведения кормовых организмов
Потребности подращиваемой личинки в кормовых организмах увеличивается по мере роста. В связи с этим разведение дафнии следует разделить на несколько этапов: 1-5 день подращивания, 5-10, 11-15. Размер бассейна для разведения дафнии 12 х 3 х 0,7, площадь – 36 м2, объем ...
Биологическое действие холина.
Холин в организме играет важную роль. Соединяясь с уксусной кислотой, он образует ацетилхолин - химический медиатор нервной системы. Очень много ацетилхолина обеспечивает в организме проведение возбудимости от нервов к исполнительным органам. В свою очередь холин явля ...