Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Для интеграции генов биосинтеза эктоина из M. marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 был выбран вектор, мини-транспозон pBSL-180. Кассета для интеграции, входящая в состав pBSL-180, содержала конститутивный промотор метанолдегидрогеназы Pmax и ectABC гены. Данный вектор был сконструирован следующим образом. ПЦР-фрагмент, содержащий промоторную область Pmax, амплифицировали с плазмиды pCM-160, используя праймеры PmaxF-PmaxR, и клонировали по сайтам EcoRI и BamHI в pBSL-180 с образованием вектора pBSL/Pmax. ДНК-фрагмент, кодирующий гены биосинтеза эктоина ectABC, был амплифицирован из M. marina с использованием праймеров Ect-operC(hal) и Ect-operN(hal). ПЦР-фрагмент клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и HindIII в плазмиду pBSL/Pmax c образованием pBSL/Pmax/ectABC размером около 9 т.п.н. ( Рис 14)

Рис. 14. Схема клонирования генов биосинтеза эктоина(ectABC) из M. marina под промотором метанолдегидрогеназы(Pmax) в мини-транспозон pBSL-180.

Конструкцию pBSL/Pmax/ectABC трансформировали в клетки E. coli S-17(גpir). Полученные трансформанты E. coli использовали для конъюгации в дикий штамм M. extorquens AM1. Трансформанты M. extorquens, содержащие плазмиду pBSL180/Pmax/ectABC, выращивали на агаризованой минеральной среде К с метанолом и канамицином.

Наличие интегрированной кассеты Pmax/ectABC в хромосоме M. extorquens AM1 оценивали ПЦР с праймерами PmaxF и ectArev на Pmax и ectA (Рис 15).

M

~700 п.н.

Рис.15 Электрофорез ПЦР продуктов генов Pmax и ectA с использованием праймеров:

PmaxF и ectARev, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Трансформанты M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) выращивали на среде К с канамицином, клетки собирали центрифугированием. Экстракцию эктоина из клеток метанолом проводили в течение 2 ч. В полученных метанольных экстрактах количество эктоина анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе высокого давления Prominence, оснащенным детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония).

В полученных трансформантах M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) был обнаружен эктоин в концентрации 75 мкг на 100 мг сухих клеток (Рис. 16с), что свидетельствует об экспрессии генов ectABC с промотора Pmax.

А)

Б)

С)

Рис. 16 Анализ накопления эктоина используя метод ВЭЖХ: а) контроль эктоина (“Sigma”), б) дикий штамм M. extorquens AM1, с) рекомбинантный штамм M. extorquens AM1.


Также смотрите:

Влияние алкогольной интоксикации и процессов старения на активность креатинфосфокиназы и ее изоферментов
В отделе фармакологии Института экспериментальной медицины АМН СССР (Ленинград) проводили опыты по выявлению возрастных изменений активности КФК в сыворотке крови интактных животных в возрасте 4 и 24 месяцев, а также изучали влияние острой алкогольной интоксикации на ...

Жизненный цикл чешуекрылых
Весь жизненный цикл чешуекрылых делится на 4 стадии: яйцо, гусеница (личинка), куколка и взрослая особь, т. е. летающая бабочка или мотылек. Последняя стадия обеспечивает расселение вида на новых территориях, а также является репродуктивной фазой, во время которой про ...

Методы научного познания
Описанные выше уровни научного познания представляют собой методы эмпирического и теоретического освоения действительности. Родоначальниками метода и методологии в науке, как уже отмечалось выше, были Ф. Бэкон и Р. Декарт в XVII веке. «Под методом, — писал Декарт, — я ...