BioFine

Для конструирования продуцента ДАБ-ацетилтрансферазы ген ectА клонировали в экспрессирующий вектор pET28, определяющий синтез рекомбинантного белка с дополнительными 6 His на С-конце. Полученной плазмидой pETectA трансформировали E. coli BL21(DE3). В растворимой фракции лизата клеток E. сoli, после индукции ИПТГ, методом денатурирующего гель-электрофореза в присутствии SDS обнаружен белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе около 20 кДа (Рис. 17), которая согласуется c рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (18.88 кДа).

Рис. 17. Электрофорез в 12.5%-ном SDS-ПААГ: 1 - маркерные белки; 2 – ДАБ-ацетилтрансфераза

В контрольных клетках E. coli (выращенных без индуктора) соответствующая белковая полоса отсутствовала. Очистку белка проводили методом аффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе. В результате был получен гомогенный препарат EctA-His6-tag (Рис. 16). Электрофоретическая подвижность белка EctA из M. marina соответствует молекулярной массе около 20 кДа, которая согласуется c теоретически рассчитанным значением 20.0 кДа. При гель-фильтрации полученного препарата на Ultrogel AcA54 пик активности белков соответствовал молекулярной массе 40 кДа, что соответствует молекулярной массе гомодимерной формы данного фермента.

Физико-химические свойства ДАБ-ацетилтрансферазы. Температурный оптимум фермента составил +15°C (Рис. 18). Фермент активен в диапазоне рН от 7 до 9 с оптимумом при рН 8 (Рис. 19).

Рис.18 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от температуры.

Рис.19 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от pH.

Ранее ДАБ-ацетилтрансфераза была частично охарактеризована у H. elongata (Ono et al., 1999), Mm. alcaliphilum 20Z (Reshetnikov et al., 2006), M. alcalica и M. talassica (Mustakhimov et al., 2008). Необычно низкий температурный оптимум – около 15ºС является главной отличительной особенностью этого фермета у M. marina по сравнению с ДАБ-ацетилтрнсферазами из выделенными из Mm. alcaliphilum 20Z, M. thalassica и M. alcalica. Общим свойством ферментов из вышеперечисленных метилотрофов и M. marina является близкая электофоретическая подвижность, соответствующая ~20 кДа (табл. 6). Однако, по некоторым свойствам ДАБ-ацетилтрансфераза из M. marina отличается от ферментов из Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica, имеющих максимальные активности при температурах, соответственно, 20, 35, 30°C и рН 9.5, 9.0 и 8.5.

Таблица 6. Свойства ДАБ-ацетилтрансфераз галофильных бактерий.

Также смотрите:

Химическая природа и свойства витамина В6.
По своей природе витамин В6 является производным пиридина. Витамин В6 - белый кристаллический порошок, растворим в воде и спирте, но плохо растворим в эфире и хлороформе. Он имеет температуру плавления 160°,обладает горьким вкусом. Максимумы спектров поглощения находя ...

Характеристика наиболее распространенных пряно-ароматических трав нашей территории
Аир (Асоrus саlamus L.). Синонимы: ир, ирный корень, гаир, я пер, татарское зелье, сабельник, калмус. Травянистый многолетник семейства арендных Родина – Азия. В XIII веке аир был завезен татарами в Польшу, где и был введен в культуру, а затем в одичавшем состоянии ...

Структура научного знания
Под термином «наука» обычно понимается особая сфера деятельности людей, главной целью которой является выработка и теоретическая систематизация объективных знаний обо всех сторонах и областях действительности. При таком понимании сущности науки она представляет собой ...