Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Клонирование и экспрессия генa ectА из M. marina
Страница 1

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Клонирование и экспрессия генa ectА из M. marina

Для конструирования продуцента ДАБ-ацетилтрансферазы ген ectА клонировали в экспрессирующий вектор pET28, определяющий синтез рекомбинантного белка с дополнительными 6 His на С-конце. Полученной плазмидой pETectA трансформировали E. coli BL21(DE3). В растворимой фракции лизата клеток E. сoli, после индукции ИПТГ, методом денатурирующего гель-электрофореза в присутствии SDS обнаружен белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе около 20 кДа (Рис. 17), которая согласуется c рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (18.88 кДа).

Підпис:

Рис. 17. Электрофорез в 12.5%-ном SDS-ПААГ: 1 - маркерные белки; 2 – ДАБ-ацетилтрансфераза

В контрольных клетках E. coli (выращенных без индуктора) соответствующая белковая полоса отсутствовала. Очистку белка проводили методом аффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе. В результате был получен гомогенный препарат EctA-His6-tag (Рис. 16). Электрофоретическая подвижность белка EctA из M. marina соответствует молекулярной массе около 20 кДа, которая согласуется c теоретически рассчитанным значением 20.0 кДа. При гель-фильтрации полученного препарата на Ultrogel AcA54 пик активности белков соответствовал молекулярной массе 40 кДа, что соответствует молекулярной массе гомодимерной формы данного фермента.

Физико-химические свойства ДАБ-ацетилтрансферазы. Температурный оптимум фермента составил +15°C (Рис. 18). Фермент активен в диапазоне рН от 7 до 9 с оптимумом при рН 8 (Рис. 19).

Рис.18 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от температуры.

Рис.19 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от pH.

Ранее ДАБ-ацетилтрансфераза была частично охарактеризована у H. elongata (Ono et al., 1999), Mm. alcaliphilum 20Z (Reshetnikov et al., 2006), M. alcalica и M. talassica (Mustakhimov et al., 2008). Необычно низкий температурный оптимум – около 15ºС является главной отличительной особенностью этого фермета у M. marina по сравнению с ДАБ-ацетилтрнсферазами из выделенными из Mm. alcaliphilum 20Z, M. thalassica и M. alcalica. Общим свойством ферментов из вышеперечисленных метилотрофов и M. marina является близкая электофоретическая подвижность, соответствующая ~20 кДа (табл. 6). Однако, по некоторым свойствам ДАБ-ацетилтрансфераза из M. marina отличается от ферментов из Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica, имеющих максимальные активности при температурах, соответственно, 20, 35, 30°C и рН 9.5, 9.0 и 8.5.

Таблица 6. Свойства ДАБ-ацетилтрансфераз галофильных бактерий.

Свойства

M. thalassica

M. alcalica

M. alcaliphilum

M. marina

Оптимум pH

8.5

9.5

9.5

8

Оптимум темпратуры, ºC

30-35

30-35

20

15

Молекулярная масса

(SDS-ПААГ электрофорез)

20 kДa

20 kДa

20 кДa

20 кДa

Молекулярная масса

(гель фильтрация)

40 kДa

40 kДa

40 кДa

40 кДa

Kм (ДАБ)

0.365 мM

0.375 мM

0.465 мM

Kм (ацетил-КоА)

76 мкM

30 мкM

36.7 мкM

Ингибиторы (1 мM)

Zn2+ Cd2+ Cu2+

Zn2+ Cd2+ Cu2+

Zn 2+ Cd 2+

Оптимальная концентрация KCl, М

0

0

0.25 М

Оптимальная концентрация NaCl, М

0

0

0.1-0.2 М

0.1 М

Стабильность

Стабилен *

Стабилен*

Стабилен *

Нестабилен *

Страницы: 1 2


Также смотрите:

Среды для выделения и идентификации микобактерий
Выделение возбудителя является более эффективным, чем бактериоскопия, и позволяет выявить 20 - 100 и более микобактерий в 1 мл исследуемого материала, а также определить их устойчивость к лекарственным препаратам, вирулентность, типовую принадлежность и другие важные ...

Экскурсия в лес. Ведение экскурсии
Экскурсия в лес имеет целью познакомить экскурсантов с теми животными, жизнь которых более или менее тесно связана с лесом, как совокупностью древесных пород, дающих пищу (непосредственно или косвенно) и приют различным представителям животного мира. Какие приемы долж ...

Эволюция полигенных систем
Гены, каждый из которых сам по себе дает незначительный кумулятивный эффект, а в сумме контролируют непрерывную изменчивость, называют полигенами. Особенно много занимался исследованиями в этой области английский ученый К. Мазер. Между генами с сильным действием (глав ...