Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы N

Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [61].

Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO4, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Реакцию проводили 120 мин при 37oC и останавливали прибавлением 30 мкл 10 % трихлоруксусной кислоты.

Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H2O.

Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.


Также смотрите:

Распознавание своего изображения в зеркале
Дельфины распознают свое собственное отражение в зеркале, а среди животных это очень редко встречаемая способность, помимо человека обнаруженная лишь у крупных приматов – шимпанзе, горилл и орангутангов. Большинство животных, включая мелких приматов, обезьян и слонов, ...

Проблема происхождения жизни
В биологии эволюционные изменения – это те, благодаря которым потомки какой-нибудь группы организмов начинают радикально отличаться от своих предков морфологически, физиологически и психологически. Процесс эволюции на нашей планете тесно связан с процессом эволюции Вс ...

Сопряжение с эффекторными системами
ГТФ-связываюшие белки управляют несколькими мембранными ферментами и рядом ионных каналов. Вероятно с G-белками взаимодействует цитоскелет, благодаря чему гормоны регулируют секрецию и эндоцитоз. Из мембранных и внутриклеточных мишеней G-белков лучше всего изучены ад ...