Способы прямого введения гена в клетку
Страница 2

Биология » рДНК-биотехнология. Способы биотрансформации клеток » Способы прямого введения гена в клетку

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к апициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и средний сегмент проинсулина.

С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.

Страницы: 1 2 


Также смотрите:

Биологизация и экологизация
В настоящее время все больше приобретают популярность идеи экологизации и в более широком смысле биологизации всей хозяйственной и производственной деятельности. Под экологизацией, как начальным этапом биологизации, можно понимать сокращение вредных выбросов производ ...

Ареал распространения соболя
Соболь - зверек прекрасно организованный, экологически очень пластичный и жизнестойкий. Это сильный и ловкий хищник, великолепный разносторонний охотник, однако может подолгу и безущербно питаться растительной пищей (орехи, ягоды). Он хорошо приспособлен к глубокоснеж ...

Краткая эколого-биологическая характеристика стрекоз
Красотки (Calopterygidae) Красотки, пожалуй, действительно самые красивые стрекозы. Самцы отличаются от самок затемненными крыльями. Эти стрекозы в Прибайкалье очень редки и заслуживают охраны. Красотка блестящая (Calopteryx splendens), самец Красотк ...