Способы прямого введения гена в клеткуСтраница 2
Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.
В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к апициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и средний сегмент проинсулина.
С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.
Также смотрите:
Общая характеристика нервной системы
Нервная система связывает в организме рецепторы, ткани и органы в рефлекторные дуги. Через рефлекторные дуги осуществляются приспособительные реакции — рефлексы, приспособление состояния и деятельности тканей, органов и организма в целом к условиям внутренней и внешне ...
Ламаркизм
Ж.Б. Ламарк, ботаник при Королевском ботаническом саде, первый предложил развернутую концепцию эволюции органического мира. Он остро осознавал необходимость формулирования новых теоретических целей, методологических установок биологического познания; потребность в обо ...
Биотехнология – «Живая вода» экономики
Антибиотики, витамины, закваски, дрожжи, ферменты для производства спирта… Биотехнологии прочно вошли в нашу жизнь.
Общий объем производства биотехнологической продукции – сюда входят лекарства, вакцины, пищевые продукты, генно-инженерные препараты и многое другое – ...