Способы прямого введения гена в клетку
Страница 2

Биология » рДНК-биотехнология. Способы биотрансформации клеток » Способы прямого введения гена в клетку

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к апициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и средний сегмент проинсулина.

С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.

Страницы: 1 2 


Также смотрите:

Биотехнология и лекарственные средства
Перспективным направлением является развитие генных технологий. 1. Они способны существенно оптимизировать традиционную фармакотерапию (фармакогеномика). 2. Особые надежды возлагаются на генно-инженерные разработки препаратов для защиты от инфекционных болезней и па ...

Жан Риолан
Возглавил борьбу против Гарвея Жан Риолан-сын. В 1648 году Риолан опубликовал труд «Руководство по анатомии и патологии», в котором подверг критике учение о циркуляции крови. Он не отвергал его в целом, но высказал так много возражений, что, по сути зачеркивал, открыт ...

Химические процессы и энергетика
В настоящее время трудно переоценить развитие различных отраслей химической промышленности, как и достижений химической науки. Химизация народного хозяйства неотъемлема от технического прогресса, тесно связана с ним. В мире выходит более 7000 научных журналов, публику ...