BioFine

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к апициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и средний сегмент проинсулина.

С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.

Также смотрите:

Спектр совместимых растворимых веществи их распространение у микроорганизмов
Спектр совместимых растворимых веществ, обнаруженных у прокариот и эукариот, весьма широк и разнообразен (Roberts, 2004; 2005). Термин “совместимые растворимые вещества” был предложен для соединений, которые не ингибируют метаболические процессы, но защищают клетку и ...

Скорость проведения
Скорость проведения потенциала действия зависит от того, насколько быстро и насколько далеко впереди от активного участка происходит, благодаря распространению положительного заряда, деполяризация мембраны до порогового уровня. Это, в свою очередь, зависит от величины ...

Экономические аспектыю Причиняемый вред
Некоторые водоросли наносят экономический ущерб или по крайней мере доставляют большие неприятности. Они загрязняют источники воды, часто придавая ей неприятный вкус и запах. Некоторые массово размножившиеся виды вполне можно идентифицировать по специфическому для них ...