Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ºС до оптической плотности А600 = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3×0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni2+-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His6-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).

Гель-фильтрацию белка EctAhal1-His6, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5×90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).


Также смотрите:

Снаряжаем экспедицию
Прежде чем приступить к сбору растений, нужно приготовить для этого нехитрые, но очень полезные приспособления. Это, прежде всего, гербарная папка. Сделать ее совсем несложно. Вам понадобятся два листа картона формата А3. Их складывают вместе и проделывают в углах отв ...

Независимая сегрегация и независимое комбинирование
Взгляд Менделя на наследственность у эукариот определялся двумя главными обнаруженными им явлениями. Первое-существование независимой сегрегации. Любой организм содержит пару генов для любого одиночного наследуемого признака, при этом каждый из членов пары имеет либо ...

Применение витамина Р.
Витамин Р (цитрин,рутин) применяют не только как средство профилактики кровоточивости каппиляров,его назначают как хорошое лечебное средство при ревматизме, воспалении почек (гломерулонефрит), при гипертонической болезни и др. Этот препарат противопоказан при повышенн ...