Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ºС до оптической плотности А600 = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3×0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni2+-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His6-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).

Гель-фильтрацию белка EctAhal1-His6, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5×90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).


Также смотрите:

Примеры модификационной изменчивости
У человека: 1) увеличение уровня эритроцитов при подъеме в горы 2) увеличение пигментации кожи при интенсивном воздействии ультрафиолетовых лучей 3) развитие костно-мышечной системы в результате тренировок шрамы (пример морфоза) У насекомых и других животных: 1) ...

Развитие конечностей
Вторым новшеством, естественно последовавшим за упрочением неокинетической системы с ее суставчатыми рычагами и поперечнополосатыми мышцами, было развитие у животных конечностей. У низших, бесскелетных организмов не было конечностей, в лучшем случае вместо них иногда ...

Биология выдры. Морфологическое описание
Выдра - среднего размера, коротконогий зверь. Вес взрослых самцов может достигать десяти килограммов. Жизнь в воде сказывается на всем строении ее тела и облике. Длинное, гибкое туловище. Благодаря наличию плавательных перепонок между пальцами передних и задних конечн ...