Градиентная элюция

Вместо ступенчатой элюции может оказаться целесообразным постепенно увеличивать концентрацию соли, то есть перейти на элюцию непрерывным градиентом концентрации соли. Линейным или нелинейным - чтобы сократить разрыв между пиками.

В ситуации, изображенной на рис. целесообразно использовать "вогнутый" градиент концентрации соли: медленно нарастающей в области ее малых значений и круто - в области больших концентраций. Это приблизит пик белка 5 к остальным и тем самым сократит время хроматографии.

Я привел для примера способ выбора содержания соли в элюенте в случае уже выбранного рН буфера. Аналогичный опыт можно поставить и для исследования влияния рН при одной определенной концентрации соли. (Напомню, что величина рН обязательно влияет на состояние ионогенных групп белка и, следовательно, на распределение зарядов по поверхности белковой глобулы. В случае использования слабого ионообменника от рН зависит и количество активных ионов на матрице) Далее результаты обоих опытов можно разумно объединить, варьируя (ступенчато или в градиенте) оба параметра. Возможно, что придется сменить ионообменник или существенно удлинить колонку.

Если, несмотря на все усилия, разделить белки смеси в одном хроматографическом опыте не удастся, то можно вышедшие из колонки фракции неразделившихся белков объединить и внести в колонку с другим ионообменником или использовать другой вид хроматографии.

Нередко перед исследователем стоит задача очистки одного определенного белка из смеси с другими. В этом случае оптимальные условия элюции подбирают так, чтобы остальные белки, не разделяясь, отходили от нужного белка в ту или другую сторону, т.е. элюировались раньше него или задерживались на колонке.

Резюмируя, следует заключить, что использование способа фракционирования белков методом ионообменной хроматографии требует весьма серьезной и вдумчивой предварительной работы по оптимизации условий проведения этой хроматографии.

Разумеется, задача еще усложняется, если в распоряжении исследователя нет чистых белков, входящих в состав фракционируемой смеси. В этом случае приходится довольствоваться либо литературными данными об их свойствах, либо вести подбор условий используя по возможности близкие аналоги отсутствующих белков.


Также смотрите:

Оценка чистоты препаратов
Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности преп ...

Материалы и методы исследования. Материал исследования
Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических больных. Кровь брали из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000 g и получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептида ...

Мохообразные Тверской области
Территория Тверской области расположена в лесной зоне, в подзоле южной тайги, переходящей в смешанные широколиственно-хвойные леса. Массивы лесов покрывают более половины ее площади. В растительном покрове области насчитывается более 1600 видов высших растений, из к ...