Применение аналитического ультрацентрифугирования. Определение молекулярных весов

Биология » Центрифугирование » Применение аналитического ультрацентрифугирования. Определение молекулярных весов

Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования: определение скорости седиментации, метод седиментациоиного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию.

Определение молекулярного веса по скорости седиментации — это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.

Скорость седиментации определяется следующим соотношением:

где х — расстояние от оси вращения в см,

t — время в с,

w — угловая скорость в рад-с-1,

s — коэффициент седиментации "молекулы.

Коэффициент седиментации — это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сеедберга; 1 единица Сведберга равна 10_13с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35S, субъединицы рибосом бактерий — от 30 до 50S, а субъединицы рибосом эукариотов — от 40 до 60S.

где М — молекулярный вес молекулы, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, s — коэффициент седиментации молекулы, D — коэффициент диффузии молекулы, v — парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р — плотность растворителя.

Метод седиментациоиного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 000—8 000 об-мин-1, чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных — с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества 'согласно формуле

где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, ю — угловая скорость, р — плотность растворителя, v — парциальный удельный объем, сх и с2— концентрация растворенного вещества на расстояниях гг и г2 от оси вращения.

Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время — от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.

Метод приближения к седиментационному равновесию был разработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для 'установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам:

где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, v — парциальный удельный объем, р — плотность растворителя, dcldr — градиент концентрации макромолекулы, гм и гд— расстояние до мениска и дна пробирки соответственно, см и сд— концентрация макромолекул у мениска и у дна пробирки соответственно, Мм и MR—величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно.


Также смотрите:

Общие принципы регуляции синтеза ферментов.
Регулирование конечным продуктом активности аллостерического фермента определенного биосинтетического пути обеспечивает мгновенную реакцию, приводящую к изменению выхода этого продукта. Если последний оказывается ненужным, отпадает надобность и в ферментах, участвующи ...

Трансдукция химических стимулов
Трансдукция механических стимулов происходит в самых разнообразных сенсорных клетках, расположенных в коже, мышцах, связках и внутренних органах. Чувствительные волосковые клетки внутреннего уха являются примером механизма, за счет которого деформация преобразуется в ...

Независимая сегрегация и независимое комбинирование
Взгляд Менделя на наследственность у эукариот определялся двумя главными обнаруженными им явлениями. Первое-существование независимой сегрегации. Любой организм содержит пару генов для любого одиночного наследуемого признака, при этом каждый из членов пары имеет либо ...