Автоматический секвенатор
Страница 3

Все это очень трудно. Быть может технически разрешимо за счет усложнения и удорожания специальной аппаратуры. Но зачем? Ведь, кроме секвенирования ДНК, при проведении любой другой исследовательской работы электрофорез используется не более, чем несколько раз . Но вернемся к прерванному рассмотрению вопроса об использовании автоматических секвенаторов.

Уже упоминалось, что в одном треке пластины или в капилляре автоматического секвенатора удается надежно определить последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК длиной в 500-600 пар нуклеотидов. Каким же образом расшифровывают весь геном, хотя бы бактерии, где счет идет на миллионы пар? Очевидно здесь пока нет иного пути, чем разбиение всей ДНК генома на куски: сначала более крупные, потом мельче — вплоть до набора фрагментов, доступных для автоматического секвенирования. Средством разбиения могут служить различные рестриктазы или облучение ультразвуком. Сортировку кусков и фрагментов ДНК по размерам можно вести последовательно электрофорезом в мягких гелях агарозы с последующим извлечением их из этих гелей. Отбираются только достаточно крупные фрагменты.

Для обеспечения строгой одинаковости этих крупных кусков ДНК их приходится проводить через операцию умножения клонированием в E.coli. Обычные плазмиды могут вносить в бактерию фрагменты, не длиннее нескольких тысяч пар нуклеотидов. Ограничением служит процесс проникновения перегруженных плазмид в бактериальную клетку. Чтобы обойти эту трудность иногда в качестве переносчиков («векторов») используют так называемые «космиды». Они представляют собой такие гипермо-дифицированные плазмиды, включенные в головку бактериофага «^». (Используется явление самосборки фага.) Бактериофаг впрыскивает всю содержащуюся в нем ДНК через отверстие, которое он «прокалывает» в оболочке бактерии. Эта ДНК в бактериальной клетке циркулизируется и размножается как плазмида. Таким образом удается размножить в E.coli куски чужеродной ДНК длиной в 35-45 тысяч пар нуклеотидов.

Некоторые из секвенированных в конце концов фрагментов ДНК неизбежно обнаружат определенное «перекрытие» — совпадение участков последовательностей. Это обстоятельство в силу уникальности таких последовательностей (при достаточной их длине) используют для установления очередности фрагментов и получения из их совокупности единой последовательности нуклеотидов всего генома.

Впрочем, может оказаться и так, что из-за потери малых отрезков исходной ДНК генома при его дроблении между некоторыми расшифрованными фрагментами обнаруживаются пропуски (перекрытие отсутствует). Если два соседствующие с таким пропуском фрагмента уже секвенированы, то конец одного и начало второго из них позволяют синтезировать два праймера (начальный и концевой) и воспользоваться симметричной ПЦР-реакцией для получения на базе всей исходной ДНК или крупного ее куска пропущенной последовательности для ее секвенирования.

Если же нет достаточных оснований, чтобы после пропуска поставить один из расшифрованных фрагментов, то придется использовать асимметричную (с одним праймером) ПЦР-реакцию, начинающуюся от предшествовавшего пропуску фрагмента. Быть может даже в несколько этапов, когда праймер для каждого последующего секвенирования придется устанавливать по концу последовательности, расшифрованной на предыдущем этапе. И так до тех пор, пока не появится достаточно длинная последовательность нуклеотидов, уже обнаружившая себя в одном из секвенированных фрагментов. Разумеется, перебор и сопоставление всех последовательностей выполняет компьютер.

Необходимость секвенирования тысяч фрагментов ДНК ставит перед исследователем весьма трудоемкую задачу. Однако благодаря возможности автоматически секвенировать за один день 96 фрагментов и параллельного использования нескольких автоматов эта задача оказывается не такой уж страшной.

Страницы: 1 2 3 4


Также смотрите:

Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента
Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность, ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мк ...

Минеральное и азотное питание
Минеральные элементы накапливаются в слоевище лишайника в весьма значительных количествах. Так, в напочвенном лишайнике Diploschistes scruposus содержание цинка в слоевище достигает 9,3 % сухой массы. Высокое содержание в лишайниках серы, свинца, олова, кадмия, железа ...

Витамин В15 - пангамовая кислота.
В 1951 г. Кребс выделил из рисовых отрубей, дрожжей и печени лошади вещество, которое оказалось хорошим средством при сердечно-сосудистых заболеваниях склеротического и ревматического характера. По своей химической природе это вещество является азотистым сложного эфи ...