Автоматический секвенатор
Страница 3

Все это очень трудно. Быть может технически разрешимо за счет усложнения и удорожания специальной аппаратуры. Но зачем? Ведь, кроме секвенирования ДНК, при проведении любой другой исследовательской работы электрофорез используется не более, чем несколько раз . Но вернемся к прерванному рассмотрению вопроса об использовании автоматических секвенаторов.

Уже упоминалось, что в одном треке пластины или в капилляре автоматического секвенатора удается надежно определить последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК длиной в 500-600 пар нуклеотидов. Каким же образом расшифровывают весь геном, хотя бы бактерии, где счет идет на миллионы пар? Очевидно здесь пока нет иного пути, чем разбиение всей ДНК генома на куски: сначала более крупные, потом мельче — вплоть до набора фрагментов, доступных для автоматического секвенирования. Средством разбиения могут служить различные рестриктазы или облучение ультразвуком. Сортировку кусков и фрагментов ДНК по размерам можно вести последовательно электрофорезом в мягких гелях агарозы с последующим извлечением их из этих гелей. Отбираются только достаточно крупные фрагменты.

Для обеспечения строгой одинаковости этих крупных кусков ДНК их приходится проводить через операцию умножения клонированием в E.coli. Обычные плазмиды могут вносить в бактерию фрагменты, не длиннее нескольких тысяч пар нуклеотидов. Ограничением служит процесс проникновения перегруженных плазмид в бактериальную клетку. Чтобы обойти эту трудность иногда в качестве переносчиков («векторов») используют так называемые «космиды». Они представляют собой такие гипермо-дифицированные плазмиды, включенные в головку бактериофага «^». (Используется явление самосборки фага.) Бактериофаг впрыскивает всю содержащуюся в нем ДНК через отверстие, которое он «прокалывает» в оболочке бактерии. Эта ДНК в бактериальной клетке циркулизируется и размножается как плазмида. Таким образом удается размножить в E.coli куски чужеродной ДНК длиной в 35-45 тысяч пар нуклеотидов.

Некоторые из секвенированных в конце концов фрагментов ДНК неизбежно обнаружат определенное «перекрытие» — совпадение участков последовательностей. Это обстоятельство в силу уникальности таких последовательностей (при достаточной их длине) используют для установления очередности фрагментов и получения из их совокупности единой последовательности нуклеотидов всего генома.

Впрочем, может оказаться и так, что из-за потери малых отрезков исходной ДНК генома при его дроблении между некоторыми расшифрованными фрагментами обнаруживаются пропуски (перекрытие отсутствует). Если два соседствующие с таким пропуском фрагмента уже секвенированы, то конец одного и начало второго из них позволяют синтезировать два праймера (начальный и концевой) и воспользоваться симметричной ПЦР-реакцией для получения на базе всей исходной ДНК или крупного ее куска пропущенной последовательности для ее секвенирования.

Если же нет достаточных оснований, чтобы после пропуска поставить один из расшифрованных фрагментов, то придется использовать асимметричную (с одним праймером) ПЦР-реакцию, начинающуюся от предшествовавшего пропуску фрагмента. Быть может даже в несколько этапов, когда праймер для каждого последующего секвенирования придется устанавливать по концу последовательности, расшифрованной на предыдущем этапе. И так до тех пор, пока не появится достаточно длинная последовательность нуклеотидов, уже обнаружившая себя в одном из секвенированных фрагментов. Разумеется, перебор и сопоставление всех последовательностей выполняет компьютер.

Необходимость секвенирования тысяч фрагментов ДНК ставит перед исследователем весьма трудоемкую задачу. Однако благодаря возможности автоматически секвенировать за один день 96 фрагментов и параллельного использования нескольких автоматов эта задача оказывается не такой уж страшной.

Страницы: 1 2 3 4


Также смотрите:

Структура, эмпирический и теоретический уровни и цель естественнонаучного познания
Естественнонаучное познание явлений и объектов природы структурно состоит из эмпирического и теоретического уровней исследования. Без сомнения, удивление и любопытство является началом научного исследования (на это впервые указывал Аристотель). Человек равнодушный, бе ...

Исследование конформационных изменений в макромолекулах
Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования — исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений или при повышенных темпера ...

Ультрацентрифуга
Этим термином принято называть центрифуги, позволяющие достигать скорости вращения своих роторов вплоть до 80 тысяч оборотов в минуту. На радиусе ротора в 6 см это создает в радиальном направлении ускорение в 700 тысяч раз превышающее ускорение земного притяжения («70 ...