Автоматический секвенатор
Страница 2

7. По окончании процесса электрофореза полученные данные обрабатываются компьютером и печатаются в виде четырехцветных графиков для каждого трека, где видна вся картина следования пиков, их нумерация и однобуквенные обозначения соответствующих нуклеотидов. Благодаря измерению интенсивности каждого цвета флюоресценции вершины пиков хорошо различимы.

Здесь необходимо сделать небольшое отступление. Хотя и было сказано, что рассматривать различные модели секвенаторов не имеет смысла, об одной из них, принадлежащей к последнему поколению, стоит вкратце написать и вот почему. Принципиальное его устройство такое же, но в интересах дальнейшего повышения продуктивности применена новинка, общие перспективы которой следует обсудить. Электрофорез в этом приборе ведут не на пластине геля, а в капиллярах! Вот, как это делается.

В прибор (Beckman СЕФ-2000) устанавливают плашку на 96 лунок (12 рядов по 8 лунок), куда заранее вносят продукты реакций, проведенных по тому же методу Сэнджера с четырьмя люминесцентно мечеными дидезоксирибонуклеотидами. Тандемом к ней ставят вторую точно такую же плашку, лунки которой заполнены буфером. Сам ПААГ готовят так, что он не может запо-лимеризоваться до твердого состояния, а представляет собой вязкую жидкость. Прибор заряжают картриджем, заполненным таким гелем. Восемь тонких и гибких пластмассовых капилляров, длиной около метра, с одного конца закреплены в пластине так, что расстояние между ними равно расстоянию между лунками одного ряда плашки. Концы капилляров выступают из пластины и одеты металлическими трубочками, электрически соединенными с катодом источника высокого напряжения. Благодаря этому в каждую лунку, куда опускаются кончики капилляров, подается отрицательное напряжение электрофореза. Вторые концы капилляров собраны в некий зажим, где они располагаются в одной плоскости вплотную друг к другу. Выходя из дальнего конца этого зажима все восемь капилляров открываются в одну емкость с буфером, куда подается положительное напряжение электрофореза. Но перед этим в окне зажима, против которого приходятся прозрачные участки капилляров, все они сканируются лучом лазера и «отвечают» на это флюоресценцией проходящего мимо фрагмента ДНК. Далее все происходит так же, как описано для секвенатора с пластиной геля.

Но вернемся к началу операции. Первоначально пустые капилляры при помощи насоса целиком заполняются гелем из картриджа. Затем концы их автоматически переносятся и опускаются в восемь лунок первого ряда плашки препаратов. Включается умеренное напряжение и все отрицательно заряженные фрагменты ДНК в течение нескольких секунд входят в гель — из каждой лунки в «свой» капилляр. После этого концы капилляров автоматически переносят в лунки первого ряда плашки с буфером. Напряжение повышается до рабочей величины электрофореза, который продолжается 2 часа. По его окончании гель, с помощью того же насоса выталкивается из капилляров, а сами они промываются водой. Затем капилляры заполняются новыми порциями геля и все операции повторяются для второго ряда лунок с препаратом. И так до последнего, 12-го ряда. За 24 часа прибор может провести электрофорез 96-ти препаратов. Если в одном капилляре удается расшифровать последовательность в 500 нуклеотидов, то всего за одни сутки прибор может определить последовательность для 49 тысяч нуклеотидов. Кроме того оператор освобождается от трудоемкого приготовления пластин с гелем и деликатной операции внесения исходных препаратов в его «карманы».

Технический прогресс впечатляет. Но поясню, ради чего было сделано это отступление. Каковы перспективы электрофореза в капиллярах? Не вытеснит ли он классический метод электрофореза в пластинах? Думаю, что не вытеснит и вот почему. В капиллярном методе у экспериментатора нет возможности получить в свое распоряжение сам чистый гель без оболочки, а значит и решить целый ряд задач, описанных в гл. 6. К примеру, как использовать электрофорез в капиллярах для сравнения картин распределения по размерам белков или НК разного происхождения? Пометить их всех люминесцентной меткой и протягивать сплошь прозрачные капилляры мимо лазера, фиксируя времена прохождения каждого из белков или НК? Сложно! А если возникнет необходимость подробнее познакомиться с одним из белков? Найти его снова по времени регистрации и вырезать кусочек капилляра? Или, не меняя описанной конструкции фиксировать времена выхода всех белков из капилляров и сохранять их для последующего анализа? Тогда для каждого капилляра надо поставить свой коллектор фракций, как при хроматографии! А если белки или НК помечены радиоактивной меткой? Укладывать капилляры с гелем на рентгеновскую пленку? Для регистрации в таких условиях потребуется очень большая радиоактивность. Еще хуже с использованием иммунохимических методов для отыскания нужного антигена после электрофореза смеси белков. К белкам в капилляре не подобраться. Значит тестировать антисывороткой поодиночке каждый белок в варианте с коллекторами фракции? И так далее.

Страницы: 1 2 3 4


Также смотрите:

Редкие виды насекомых природного парка
Среди собранных насекомых нами отмечены такие редкие виды, занесенные в Красную книгу Волгоградской области, как пурпуриценус бунзис, жук-олень, махаон, подалирий, поликсена и ксилокопа фиолетовая. Они нуждаются в особых мерах охраны, в том числе в нашей защите. И тол ...

Классификация водорослей
В прошлом водоросли считались примитивными растениями (без специализированных проводящих, или сосудистых, тканей); их выделяли в подотдел водорослей (Algae), который вместе с подотделом грибов (Fungi) составлял отдел талломных (слоевцовых), или низших растений (Thallo ...

Биография
Уильям Гарвей — основатель современной физиологии и эмбриологии, родился 1 апреля 1578 года в городе Фолкстон, расположенном на юго-восточном побережье Англии в графстве Кент. Его дед — Джон Гарвей — разводил овец. Отец — Томас Гарвей — содержал почтовую станцию для с ...