Молекулярно-биологические методы
Страница 1

Выделение геномной ДНК

Очистку хромосомной ДНК проводили модифицированным методом (Marmur, 1961). 1 г сырых клеток ресуспендировали в 9 мл TE-буфера (табл.3). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл. Тщательно перемешивали и инкубировали 30 мин при 37 °С. Затем добавляли 50 мкл протеиназы К (концентрация 20 мг/мл) и инкубировали 30 мин при 37 °С. К суспензии добавляли 250 мкл 20% раствора додецилсульфат натрия (SDS) и инкубировали 60 мин при 65 °С. Далее к раствору добавляли 1.8 мл 5М NaCl и 1.5 мл 10% цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) в 0.7 М NaCl. Лизат выдерживали 20 мин при 65 оС.

В лизат добавляли равный объем хлороформа (используется смесь хлороформа и изоамилового спирта - 24:1). Тщательно перемешивали и центрифугировали при 10000 об/мин, 15 мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Добавляли равный объем фенола, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали для разделения фаз. Верхнюю фазу, не затрагивая интерфазы, переносили в новую пробирку. К раствору добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа, перемешивали, центрифугировали и отбирали верхнюю фазу. Добавляли равный объем хлороформа, раствор перемешивали и центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку и добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали. Экстракцию хлороформом проводили несколько раз до просветления верхней фазы.

Для осаждения ДНК из верхней фазы добавляли 2.5 объема охлажденного 96% этанола и 0.1 объема 3 М ацетата калия, тщательно перемешивали и центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Осадок ДНК промывали последовательно 80% и 96%-ным растворами этанола и подсушивали на воздухе. ДНК растворяли в 0.5 мл ТЕ-буфера. Добавляли 10 мкл РНК-азы (10мг/мл) и инкубировали 1 ч при 37 оС. Повторяли экстракцию смесью фенола-хлороформа. ДНК из раствора осаждали добавлением 2.5 объема 96% этанола и 0.1 объем 3 М ацетат калия, перемешивали и центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Осадок ДНК промывали последовательно 80% и 96% растворами этанола и подсушивали на воздухе. Полученный осадок ДНК растворяли в 1 мл ТЕ-буфера. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре “Shimadzu UV-160” (Япония) при 260/280 нм. Растворы ДНК хранили при -20 оС

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

Гидролиз ДНК различными эндонуклеазами рестрикции проводили, согласно инструкциям фирм “СибЭнзим” (Россия) и “Fermentas” (Литва), используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим.

ДНК разделяли и визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, используя в зависимости от длины разделяемых ДНК 0.75% - 1%-ную агарозу и 1×ТВЕ буфер (табл. 3). Для оценки размеров фрагментов ДНК использовали ДНК-маркеры молекулярного веса “GeneRuler™ 100bp DNA Ladder” (“Fermentas”).

Очистка фрагментов ДНК.

Освобождение фрагментов ДНК от компонентов реакции проводили двумя способами: непосредственно из реакционной смеси или из агарозного геля после электрофореза.

Для этого к реакционной смеси или вырезанной полоске геля, содержащей нужный фрагмент ДНК, добавляли 5 объемов 5 М гуанидинтиоцианата, 0.1 М Tris-НС1 (рН 7.0) и 15 мкл суспензии кварцевого порошка “Silica” (100 мг/мл). При использовании полоски геля суспензию “Silica” добавляли после полного растворения геля. Полученную смесь центрифугировали 2 мин при 5000 об/мин. Осадок трижды промывали 750 мкл промывочного буфера (60% этанол, 80 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-НС1 рН 7.0) и высушивали. Элюцию ДНК проводили в 50 мкл буфера (10 мМ Tris-HCl, рН 8.5). В отдельных случаях фрагменты ДНК выделяли из агарозы и очищали с использованием набора “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (“Promega”, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Страницы: 1 2 3


Также смотрите:

Культурологическая стрела
В эволюции культуры четко просматриваются два направления - это развитие искусства и науки. Системообразующий фактор в эволюции культуры - естествознание, познание человеком окружающего мира и самого себя, как природных феноменов. Искусство и наука - две дополняющих д ...

Продолговатый мозг и варолиев мост
Продолговатый мозг и варолиев мост — структурно-физиологическое образование ЦНС - образованы нейронами. Они, объединяясь, образуют ядра ряда черепно-мозговых нервов — тройничных, отводящих, лицевых, слуховых, языкоглоточных, блуждающих, добавочных, подъязычных и соотв ...

Описание и классификация рыб
В настоящее время существует более 20 тысяч видов, объединяемых в класс рыб. Рыбы относятся к типу хордовых, куда также входят амфибии, рептилии, птицы и млекопитающие. Этот тип по-разному подразделяется на таксоны более низкого ранга. В аквариумах содержат несколько ...