Молекулярно-биологические методы
Страница 3

Создание праймеров и ПЦР.

Конструирование праймеров осуществляли с помощью программного пакета “VectorNTI®Advance v.9.0” и “OLIGO v.4.0”. Олигонуклеотиды синтезированы фирмой “Синтол” (Москва).

а) ПЦР с геномной ДНК проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 50-100 нг ДНК, по 0.2 мM каждого из четырёх дНТФ, 1×ПЦР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг/мл, 40 пмоль каждого праймера (табл. 10) и до 3 ед. Taq-ДНК-полимеразы (“СибЭнзим”). Цикл амплификации состоял из денатурации ДНК при 94 °С - 2 мин, последующие 30 циклов: денатурации 94 °С – 30 с, отжига праймеров при 46-54 °С (в зависимости от праймера) – 30 с, и элонгации ДНК при 72°С - 2 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72°С, 4 мин.

б) Инвертированная ПЦР.

Для этой реакции в качестве матрицы использовали фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, замкнутые в кольцо в предварительной реакции лигирования. Перед ПЦР полученную кольцевую ДНК прогревали 15 мин при 95 °С. В реакции использовали праймеры (по 20 пмоль каждый) и Taq-полимеразу, остальные компоненты реакции были те же, что в стандартной ПЦР. Реакцию (30 циклов) проводили в следующем режиме: при температура плавления 94 °С - 30 с; при температуре отжига 54 °С - 40 с; при температуре синтеза 72 °С - 4 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72 °С – 8 мин.

в) Векторетная ПЦР

Cтратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. Отжиг комплементарных последовательностей vect57 и vect53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Для стабилизизации полученного адаптера в реакционную смесь добавили MgCI2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре.

Для векторетной ПЦР хромосомную ДНК (10 нг) инкубировали в присутствии 20 ед. рестриктазы BamHI при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. Лигирование разрезанной хромасомной ДНК и адаптеров проводили в присутствии 50 ед. T4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask. Праймер C20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA.

г) Амплификацию генов биосинтеза эктоина из хромосомной ДНК (10 нг) проводили с использованием прямого и обратного праймеров (15 пмоль каждого) (табл. 10). Для амплификации полного гена ectA из M. marina использовали праймеры EAN и EAС, для гена ectB - ectBN и ectBC, для гена ectС - ectСN и ectСC и для гена ask – AskN и PET19Z или AskN и BglII. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего гены ectАВС, использовали праймеры Opr1 и Opr2. Реакцию проводили, используя смесь ДНК-полимераз Tag/Pfu в соотношении активностей 20:1. Остальные компоненты реакции были те же, что и в стандартной ПЦР.

Коньюгация.

Для коньюгации использовали штамм-донор E. coli S17-λpir, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL-180:Pmax:ectABC (полученной на основе рBSL-180). 10 мл ночной культуры E. coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “K”. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды “K”. В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AМ1. 50 мл культуры, выращенной до ОП600=0.4, центрифугировали и промывали средой “K”. Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды “K” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E. coli. Смесь переносили на агаризованную среду “К”, содержащую 0.2% Proteose peptone (“USBiological”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. После инкубации клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды “К”. Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде “К”, содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток E. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина.

Страницы: 1 2 3 


Также смотрите:

Наука среди других сфер культуры
На протяжении истории своего существования люди выработали множество способов познания и освоения окружающего мира. Среди них одно из важнейших мест занимает наука. Чтобы понять ее специфику, необходимо рассмотреть науку как часть культуры, созданной человеком, а такж ...

Сельскохозяйственное значение бабочек
Бабочки опыляют многие растения. Чешуекрылые насекомые часто используются как средство биологической борьбы с сорняками, Классическим примером служит завоз в Австралию крошечной кактусовой огневки для борьбы с непомерно разросшейся опунцией. Заросли этого кактуса окку ...

Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina
Для идентификации генов синтеза эктоина у M. marina был использован подход, основанный на ПЦР методологии. Проведенный ранне анализ опубликованных и представленных в GenBank данных свидетельствовал о том, что у исследованных видов галофильных и галотолерантных бактери ...