Молекулярно-биологические методы
Страница 3

Создание праймеров и ПЦР.

Конструирование праймеров осуществляли с помощью программного пакета “VectorNTI®Advance v.9.0” и “OLIGO v.4.0”. Олигонуклеотиды синтезированы фирмой “Синтол” (Москва).

а) ПЦР с геномной ДНК проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 50-100 нг ДНК, по 0.2 мM каждого из четырёх дНТФ, 1×ПЦР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг/мл, 40 пмоль каждого праймера (табл. 10) и до 3 ед. Taq-ДНК-полимеразы (“СибЭнзим”). Цикл амплификации состоял из денатурации ДНК при 94 °С - 2 мин, последующие 30 циклов: денатурации 94 °С – 30 с, отжига праймеров при 46-54 °С (в зависимости от праймера) – 30 с, и элонгации ДНК при 72°С - 2 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72°С, 4 мин.

б) Инвертированная ПЦР.

Для этой реакции в качестве матрицы использовали фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, замкнутые в кольцо в предварительной реакции лигирования. Перед ПЦР полученную кольцевую ДНК прогревали 15 мин при 95 °С. В реакции использовали праймеры (по 20 пмоль каждый) и Taq-полимеразу, остальные компоненты реакции были те же, что в стандартной ПЦР. Реакцию (30 циклов) проводили в следующем режиме: при температура плавления 94 °С - 30 с; при температуре отжига 54 °С - 40 с; при температуре синтеза 72 °С - 4 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72 °С – 8 мин.

в) Векторетная ПЦР

Cтратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. Отжиг комплементарных последовательностей vect57 и vect53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Для стабилизизации полученного адаптера в реакционную смесь добавили MgCI2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре.

Для векторетной ПЦР хромосомную ДНК (10 нг) инкубировали в присутствии 20 ед. рестриктазы BamHI при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. Лигирование разрезанной хромасомной ДНК и адаптеров проводили в присутствии 50 ед. T4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask. Праймер C20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA.

г) Амплификацию генов биосинтеза эктоина из хромосомной ДНК (10 нг) проводили с использованием прямого и обратного праймеров (15 пмоль каждого) (табл. 10). Для амплификации полного гена ectA из M. marina использовали праймеры EAN и EAС, для гена ectB - ectBN и ectBC, для гена ectС - ectСN и ectСC и для гена ask – AskN и PET19Z или AskN и BglII. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего гены ectАВС, использовали праймеры Opr1 и Opr2. Реакцию проводили, используя смесь ДНК-полимераз Tag/Pfu в соотношении активностей 20:1. Остальные компоненты реакции были те же, что и в стандартной ПЦР.

Коньюгация.

Для коньюгации использовали штамм-донор E. coli S17-λpir, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL-180:Pmax:ectABC (полученной на основе рBSL-180). 10 мл ночной культуры E. coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “K”. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды “K”. В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AМ1. 50 мл культуры, выращенной до ОП600=0.4, центрифугировали и промывали средой “K”. Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды “K” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E. coli. Смесь переносили на агаризованную среду “К”, содержащую 0.2% Proteose peptone (“USBiological”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. После инкубации клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды “К”. Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде “К”, содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток E. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина.

Страницы: 1 2 3 


Также смотрите:

Гистоны.
Гистоны широко распространены в природе в составе сложных белков, главным образом в ядерных белках. Молекулярный вес их значительно меньше по сравнению с альбуминами и глобулинами - около 14300.Они состоят в основном из диаминокислот: аргинина, гистидина и лизина и с ...

Вывод
Просвечивающий световой микроскоп – самое доступное средство исследования клеток, поэтому получение представления о трехмерной форме клетки при помощи него имеет более широкие возможности в плане использования большим количеством исследователей. Недостатком этого мето ...

Применение культур растительной ткани. Фундаментальные и практические аспекты
В последнее время культура растительной ткани приобрела большое значение для сельскохозяйственной промышленности. Произошло это, когда было показано, что из одной клетки, отделенной от каллуса, может быть выращено индивидуальное растение моркови, т. е. тысячи идентичн ...