Выбор условий хроматографии (например, для фракционирования смеси белков)
Страница 1

Биология » Ионообменная хроматография » Выбор условий хроматографии (например, для фракционирования смеси белков)

Этот выбор, даже для случая, когда все подлежащие разделению белки известны и, более того, имеются в чистом виде, оказывается делом непростым, требующим немалого опыта, понимания физических процессов, лежащих в основе фракционирования и даже определенной интуиции. Очень рискованно (с точки зрения потери ценного препарата) пытаться слепо повторять условия хроматографии, описанные в научной литературе даже для точно такого же или очень похожего случая. Реальные характеристики ионообменника той же марки (они варьируют от партии к партии) или используемых реактивов могут оказаться иными. Равно как и особенности исходных препаратов. Приняв к сведению описанную процедуру, исследователь должен сам продумать и спланировать свой хроматографический эксперимент. Сюда войдут, как минимум:

1. Выбор ионообменника (его силы, размера гранул, пористости).

2. Выбор геометрии колонки (длина и диаметр).

3. Выбор рН буфера с позиций как наиболее выгодных условий фракционирования, так и сохранения биологической активности всех белков смеси, например ферментов.

4. Выбор концентраций соли (контрионов) в элюенте.

5. Выбор типа элюции: изократической (с неизменной концентрацией соли), ступенчатой или градиентной (и какой формы градиента!)

6. Выбор скорости элюции.

Все эти условия надо подбирать одновременно, с учетом их взаимосвязи с целью оптимизации результатов фракционирования. Было бы слишком громоздко излагать здесь способы выбора каждого из названных параметров хроматографического процесса. Для иллюстрации остановлюсь на пунктах 4 и 5 — выборе концентрации соли и способах манипуляции этой концентрацией.

Выше было показано, что продвижение хроматографических зон связывания белков по колонке обусловлено, в частности, их десорбцией в местах первоначального и всех последующих закреплений на матрице в гранулах. За счет десорбции восстанавливается динамическое равновесие концентраций молекул в неподвижной и подвижной фазах слоя гранул, нарушенное вытеканием элюента, окружавшего этот слой. Десорбция первоначально сор-бированных молекул белка определяется концентрацией соля в жидкости внутри гранул. Если она слишком мала, то десорбции практически не происходит. Наоборот — открытые ионогенние группы матрицы как бы «высасывают» из элюента и закрепляют на себе молекулы белка. Если же концентрация соли в элюенте (а значит и внутри гранул) слишком велика, то практически все молекулы белка десорбируются с матрицы в жидкую среду, их концентрации в неподвижной и подвижной фазах уравниваются, как при гель-фильтрации.

Имея это в виду проведем мысленно следующий предварительный опыт. Выбранный ионообменник, уравновешенный уже выбранным буфером разольем равными порциями в 10 пробирок. Гранулы обменника, естественно, сядут на дно. Затем серией «декантаций« (т. е. сливом надосадочной жидкости, заменой ее на тот же буфер, но с определенной концентрацией соли, встряхиванием, осаждением — и так несколько раз) добиваемся того, чтобы концентрация соли внутри гранул постепенно увеличивалась от первой пробирки к десятой в определенных пределах (их придется подобрать для каждого белка). Затем во все пробирки внесем одинаковое количество концентрированного водного раствора одного из белков, входящих в состав подлежащей фракционированию смеси. Встряхиваем пробирки, даем отстояться осадку и по ультрафиолетовому поглощению (или ферментативной активности) оцениваем концентрацию белка в каждом из десяти супернатантов.

Находим первую пробирку, в супернатанте которой наш белок только-только появляется. Тем самым определяем концентрацию соли, при которой динамическому равновесию соответствует минимальная десорбция белка с матрицы. В последующих пробирках по мере увеличения концентрации соли, белка будет становиться все больше — десорбция при установлении динамл-ческого равновесия будет все значительнее. Наконец, придем к такой ситуации, когда концентрация белка в супернатанте окажется максимальной и при дальнейшем увеличении концентрации соли возрастать уже не будет. Концентрация соли в первой из этих пробирок укажет момент полной десорбции белка с матрзицы. В процентах от этой концентрации оценим и степень десорбции в промежуточных точках нашего анализа и построим зависимость процента десорбции данного белка от концентрации соли в условиях динамического равновесия. То же самое проделаем для всех остальных белков будущей смеси и получим серию кривых такого типа, как показана на рис.

Страницы: 1 2


Также смотрите:

Регенерация у человека и животных
Способность к регенерации широко распространена среди животных. Вообще говоря, низшие животные чаще способны к регенерации, чем более сложные высокоорганизованные формы. Так, среди беспозвоночных гораздо больше видов, способных восстанавливать утраченные органы, чем с ...

Биологическое действие витамина В2.
При недостатке в пище витамина В2 наблюдается нарушение обмена веществ в тканях организма, так как не образуется фермент, в котром простетической группой является фосфорилированный витамин В2. Витамин В2 находится во всех тканях животных, но наиболее богаты им серд ...

Собственные исследования. Методы и материалы исследований
Основной объем работы приходился на обработку протоколов, сборы данных по тактике и системе работы службы Магдагачинского охотнадзора, расчет его эффективности. В ходе исследования были использованы протоколы о нарушении правил охоты, составленные работниками отдела в ...