Определение физико-химических свойств ферментов
Страница 1

Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.

При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ºС с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).

Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.

Буферы/растворы

Применение

Состав

Компоненты

Концентрация

TBE, 5×

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Трис-HCl

Борная кислота

ЭДТА, рН 8.0

0.445 М

0.445 M

0.01 М

ТЕ-буфер

ЭДТА

Трис-HCl, рН 8.0

1 мМ

10 мМ

10×ПЦР буфер

ПЦР

Трис-НСl, рН 8.9

(NH4)SO4

MgCl2

Tween 20

670 мМ

170 мМ

1.5 мM

0.1%

10×лигазный буфер

Лигирование фрагментов ДНК

Трис-HCl, рН 7.8

MgCl2

DTT

АТФ

БСА

500 мМ

100 мМ

100 мМ

10 мМ

250мкг/мл

Раствор I

Выделение плазмидной ДНК

Глюкоза

ЭДТА

Трис-HCl, рН 8.0

50 мМ

10 мМ

25 мМ

Раствор II

Выделение плазмидной ДНК

NaOH

SDS

0.2 N

0.1%

Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.

Плазмиды

Описание

Ссылка

pCM160

OriT, OriV, Plac, PmxaF, LacZ’, KmR

Marx and Lidstrom, 2001

pET/ectA

Ген ectA из M. marina встроен в pET28b+

Данная работа

pZero-2

OriP, OriF1, Plac, KmR

“Invitrogen”

pZero/ectA

Ген ectA из M. marina встроен в pZero

Данная работа

pBSL-180

Мини-Tn10 транспозон: ori R6K, mob, nptII R, ampR, lacI, tnp

M. F. Alexeyev, 1994

pBSL-180/pmax/ectABC

Гены pmax/ectABC встроены в pBSL180

Данная работа

Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.

Праймер

Ген - мишень

Последовательность (5’-3’)

EctHal

EctA(halN)

EctA(halC)

ectArev

ectF

HalR

HalF

Tra3

Hal-REV2

CR

Rtn

Askn

Askg

AskF

Hal-AskF(ad)

Hal-REV2

Ect-operN(hal)

Ect-operC(hal)

Ect-operC2(hal)

RevHal

HalEctR-C

C 20

PmaxF

PmaxR

TF

TR

vect57

vect53

ectA

ectA

ectA

ectA

ectA

ectB

ectB

ectB

ectB

ectC

ask

ask

ask

ask

ask

ask

ectABC

ectABC

ectABC

ectR

ectR

адаптор

pmax

pmax

pZero

pZero

TTYGT(I)TGGCARGTNGC

TTCCATGGCCAAAGACGTGAACGAGAT

TTAAGCTTGGCTGCGGCCGAAGTC

GCAGCAGCTCAATTAAC

GATGGTGGTATTGAGGAGCTGC

ACCATRTCYTCRAA

CGGCTTTCGTATCGGTGTGC

ACCGG(T/C)ACITT(C/T)TT(C/T)AGITT(C/T)GA

GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC

GGIGG(A/G)TT(A/G)AANAC(A/G)CA

ACCATRTCYTGYTCRAA

TGTCGCCGATCAGECTTCCAAC

CCTTGTGGATGATCGCCTCGA

TGCTGCTGGAACACAAGAAATC

CGAGGCGATCATCCAGGAGTTC

GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC

TTGAATTCATTAGTTAGTAGGACAAGCAA

TTTGGGCCCACGCGCGACATCGAAGTGC

TTAAGCTTACGAGCGACATCGAAGTGC

TTCCGACAAGGCGCATTACAAGC

TTTAAGCTTCAGGCGGTCATCC

CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA

TTGGTACCGCTTGTCGGGCCGCTTGC

TTGAGCTCATCCGCGGTATCTCTCAGACGTT

CCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC

GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTT

GAGAGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGGAG

AGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGCTAG

CTCTCCCTTCTCGAATCGTAACCGTTCGTAC

GAGAATCGCTGTCCTCTCCTTC

Страницы: 1 2


Также смотрите:

Суточная потребность в аскорбиновой кислоте.
В связи с тем, что организм человека и большинтва животных не обладает способностью синтезировать витамин С, его следует вводить с пищей. Суточная потребность для человека колеблется от 50 до 100 мг. Основными источниками витамина С являются свежие ягоды, фрукты и ов ...

Открытие кровообращения
Уильям Гарвей пришел к выводу, что укус змеи только потому опасен, что яд по вене распространяется из места укуса по всему телу. Для английских врачей эта догадка стала исходной точкой для размышлений, которые привели к разработке внутривенных инъекций. Можно, рассужд ...

Особенности процесса старения человеческого организма
Старение имеет много общего с изнашиванием. Старение человека тоже зависит от "особенностей конструкции" природных данных, а также от "характера эксплуатации": режима труда, отдыха, питания. Для поиска причин старения человека огромное значение име ...