Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina
Страница 2

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina

Рис. 8. Схема клонирования участков ДНК, прилегающих к фрагментам с известной последовательностью.

Для расщепления хромосомной ДНК M. marina была выбрана рестриктаза ApoI. В результате ПЦР с использованием праймеров Askn и Askg (комплементарные гену ask) и кольцевых молекул ДНК был получен фрагмент ~690 п.н. (рис. 9)

M

Рис. 9. Электрофорез продуктов инвертированной ПЦР, полученных с использованием кольцевых молекул ДНК M. marina и праймеров:

Hal-askR(inv) и Hal(inv)-askF, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Анализ нуклеотидной последовательности полученного фрагмента выявил внутренную область гена ask.

Для того, чтобы выявить полную последовательность гена ask, нами была использована стратегия векторетного ПЦР. Эта стратегия основывается на создании адаптора с известной последовательностью и с сайтом рестрикции. Созданный адаптор с выступающим 5’ концом (GATC), был получен из двух комплементарных олигонуклеотидов vect57 и vect53. Гидролизованная по рестриктазе BamHI тотальная ДНК M. marina (обладающая комплементарной последовательностью к липкому 5’ концу адаптора) была лигирована с адаптором, с последующей амплифицированией используя праймер на адаптор С20 и комплементароного праймера на тотальную ДНК (рис 10).

Рис. 10. Схема векторетного ПЦР-анализа

Используя комплементарный праймер AskF на ген ask и праймер C20 на адаптор, был амплифицирован фрагмент ДНК ~1400 п.н. и севенирован(Рис 11а). В результате секвенирования ПЦР-фрагмента и анализа нуклеотидных последовательностей получили фрагмент ДНК, кодирующий полную последовательность гена ask.

Для идентификации недостающей 5’ обасти гена ectA была использована векторетная ПЦР. Используя комплементарный праймер ectF на ген ectA и С20 на адаптор, был получен ПЦР-продукт длиной ~1300 п. н. (Рис 11б) и секвенирован. Анализ нуклеотидной последовательности выявил недостающую область гена ectA.

М М

А) ~1400 п.н. б) ~1300п.н.

Рис. 11. Электрофорез продуктов векторетной ПЦР, полученных с использованием тотальной ДНК M. marina и праймеров: a) на ген ask и праймеры AskF и C 20, б) на ген ectA и праймеры ectF и C 20, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Анализ нуклеотидной последовательности, вверх по направлению от гена ectA, выявил ОРС, кодирующую белок из 184 аминокислотных остатка, проявляющий гомологию (36% идентичности) с транскрипционным белком-репрессором биосинтеза эктоина EctR из Mm. alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010). Анализ транслированной аминокислотной последовательности обнаруженной ОРС выявил поворот спираль поворот (НТН) мотив, характерный для белков регуляторов MarR семейства. Возможно, данный белок из M. marina участвует в регуляции транскрипции генов биосинтеза эктоина, по механизму, аналогичному у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010).

Таким образом, в результате секвенирования ПЦР-фрагментов и анализа нуклеотидных последовательностей был получен фрагмент ДНК (3304 п.н.), в котором обнаружены ОРС, соответствующие генам ectA, ectB, ectC и ask. Поскольку расстояния между этими генами небольшие (18, 5 и 7 п.н., соответственно), можно предположить, что гены биосинтеза эктоина у M. marina транскрибируются в составе одной полицистронной матричной РНК.

Страницы: 1 2 3


Также смотрите:

Ешь меньше — проживешь дольше
Ученые объяснили, почему низкокалорийная диета продлевает жизнь эффективнее, чем физические нагрузки. Группа немецких зоологов изучала влияние питания и физических упражнений на продолжительность жизни мышей и опубликовала результаты в журнале «American Journal of Phy ...

Влияние бактериальных токсинов на активность аденилатциклазы (АДФ-рибозилирование G-белков)
Для изучения функционирования G-белков аденилатциклазной системы были использованы экзогенные бактериальные яды холерный и коклюшный токсины. Токсины в экспериментальных условиях повышают активность аденилатциклазы практически во всех клетках организма; так, холерный ...

Фосфодиэстеразы
Фосфодиэстеразы - ферменты, катализирующие превращение цАМФ или цГМФ в неактивные метаболиты АМФ или ГМФ. Фосфодиэстеразы, снижая концентрации вторичных посредников, разрывают цепь превращений, вызванных активатором рецептора. Фосфодиэстеразы присутствуют в клетках т ...