Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina
Страница 2

Биология » Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina » Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina

Рис. 8. Схема клонирования участков ДНК, прилегающих к фрагментам с известной последовательностью.

Для расщепления хромосомной ДНК M. marina была выбрана рестриктаза ApoI. В результате ПЦР с использованием праймеров Askn и Askg (комплементарные гену ask) и кольцевых молекул ДНК был получен фрагмент ~690 п.н. (рис. 9)

M

Рис. 9. Электрофорез продуктов инвертированной ПЦР, полученных с использованием кольцевых молекул ДНК M. marina и праймеров:

Hal-askR(inv) и Hal(inv)-askF, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Анализ нуклеотидной последовательности полученного фрагмента выявил внутренную область гена ask.

Для того, чтобы выявить полную последовательность гена ask, нами была использована стратегия векторетного ПЦР. Эта стратегия основывается на создании адаптора с известной последовательностью и с сайтом рестрикции. Созданный адаптор с выступающим 5’ концом (GATC), был получен из двух комплементарных олигонуклеотидов vect57 и vect53. Гидролизованная по рестриктазе BamHI тотальная ДНК M. marina (обладающая комплементарной последовательностью к липкому 5’ концу адаптора) была лигирована с адаптором, с последующей амплифицированией используя праймер на адаптор С20 и комплементароного праймера на тотальную ДНК (рис 10).

Рис. 10. Схема векторетного ПЦР-анализа

Используя комплементарный праймер AskF на ген ask и праймер C20 на адаптор, был амплифицирован фрагмент ДНК ~1400 п.н. и севенирован(Рис 11а). В результате секвенирования ПЦР-фрагмента и анализа нуклеотидных последовательностей получили фрагмент ДНК, кодирующий полную последовательность гена ask.

Для идентификации недостающей 5’ обасти гена ectA была использована векторетная ПЦР. Используя комплементарный праймер ectF на ген ectA и С20 на адаптор, был получен ПЦР-продукт длиной ~1300 п. н. (Рис 11б) и секвенирован. Анализ нуклеотидной последовательности выявил недостающую область гена ectA.

М М

А) ~1400 п.н. б) ~1300п.н.

Рис. 11. Электрофорез продуктов векторетной ПЦР, полученных с использованием тотальной ДНК M. marina и праймеров: a) на ген ask и праймеры AskF и C 20, б) на ген ectA и праймеры ectF и C 20, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Анализ нуклеотидной последовательности, вверх по направлению от гена ectA, выявил ОРС, кодирующую белок из 184 аминокислотных остатка, проявляющий гомологию (36% идентичности) с транскрипционным белком-репрессором биосинтеза эктоина EctR из Mm. alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010). Анализ транслированной аминокислотной последовательности обнаруженной ОРС выявил поворот спираль поворот (НТН) мотив, характерный для белков регуляторов MarR семейства. Возможно, данный белок из M. marina участвует в регуляции транскрипции генов биосинтеза эктоина, по механизму, аналогичному у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010).

Таким образом, в результате секвенирования ПЦР-фрагментов и анализа нуклеотидных последовательностей был получен фрагмент ДНК (3304 п.н.), в котором обнаружены ОРС, соответствующие генам ectA, ectB, ectC и ask. Поскольку расстояния между этими генами небольшие (18, 5 и 7 п.н., соответственно), можно предположить, что гены биосинтеза эктоина у M. marina транскрибируются в составе одной полицистронной матричной РНК.

Страницы: 1 2 3


Также смотрите:

Аффинная хроматография. Общая характеристика метода
Это - самый сложный, тонкий и, пожалуй, самый капризный метод хроматографии. Но зато, в случае успеха, - фантастически эффективный! С его помощью в одной хроматографической операции удается полностью очистить вещество, представленное в смеси с другими компонентами нич ...

Висцеральный анализатор. интерорецепторы
Рецепторы, расположенные в органах, называются висцерорецепторами, или интерорецепторами. Импульсация от интерорецепторов поступает в продолговатый мозг по волокнам IX (языкоглоточного) и Х (блуждающего) нервов, проходя через чувствительные ганглии - верхний и нижний ...

Особенности процесса старения человеческого организма
Старение имеет много общего с изнашиванием. Старение человека тоже зависит от "особенностей конструкции" природных данных, а также от "характера эксплуатации": режима труда, отдыха, питания. Для поиска причин старения человека огромное значение име ...